Nachrichten

1. quantitative Echtzeit-PCR

1996wurde die quantitative Echtzeit-Polymerase-Ketten reaktion (Echtzeit-qPCR) erstmals von Applied Bio systems in den USA eingeführt. Die sogenannte Echtzeit-qPCR bezieht sich auf die Zugabe von fluor zieren den Gruppen zur PCR-Reaktion, um das Fluoreszenz signal kontinuierlich zu überwachen. Die Reihenfolge des Aussehens und die Änderung der Signalstärke können verwendet werden, um die Anfangs menge des Zielgens in Echtzeit zu analysieren. Die Erfindung dieser Technologie realisiert den Sprung von der qualitativen zur quantitativen PCR.

2. Chemikalien, die in der PCR-Fluoreszenz verwendet werden

Gegenwärtig ist die Echtzeit-QPCR in zwei Kategorien unterteilt: Fluoreszenz farbstoffe und Fluoreszenz sonden gemäß den verschiedenen verwendeten Fluoreszenz chemikalien.

3. Farbstoffe, die in der PCR-Fluoreszenz verwendet werden

Fluor zierende Farbstoffe werden auch als DNA-Bindungs farbstoffe bezeichnet. Das derzeit verwendete Haupt farbstoff molekül ist SYBR Green I. SYBR Green I kann spezifisch an die kleine DNA-Rille doppels trängig binden. Free SYBR Green I hat fast kein fluor zieren des Signal, bindet jedoch an doppels trängige DNA. Danach kann sein Fluoreszenz signal um das Hundertfache erhöht werden. Mit der Zunahme des PCR-Produkts nimmt auch die Bindungs menge an PCR-Produkt und Farbstoff zu, und die Intensität des Fluoreszenz signals repräsentiert die Anzahl der doppels trängigen DNA-Moleküle.

Die Vorteile von Fluoreszenz farbstoffen sind, dass sie einfach zu verwenden sind, mit jedem PCR-Produkt kombiniert werden können und kosten günstig sind.

Im Allgemeinen ist die SYBR Green I-Methode eines der grundlegend sten und am häufigsten verwendeten Echtzeit-qPCR-Experimente.

4. Sonden für PCR-Fluoreszenz

The most commonly used fluorescent probes in Real-time qPCR are TaqMan probes. The basic principle is to design and synthesize a probe that can specifically hybridize to the target gene. The 5' end of the probe is labeled with a fluorophore, and the 3' end is labeled with a quencher group.

Unter normalen Umständen ist der räumliche Abstand zwischen den beiden Gruppen sehr eng und das fluor zierende Gen kann aufgrund von Abschrecken nicht fluor zieren. Während der PCR-Amplifi kation binden der Primer und die Sonde gleichzeitig an die Matrize, und die Bindungs position der Sonde befindet sich zwischen den stroma ufwärts-und stroma bwärtigen Primern.

When the amplification extends to the position where the probe binds, the Taq enzyme uses the 5' exonuclease activity to cleave the fluorescent molecule attached to the 5' end of the probe from the probe, causing it to fluoresce. The number of detected fluorescent molecules is proportional to the number of PCR products, therefore, the number of initial DNA templates can be calculated according to the fluorescence intensity in the PCR reaction system.

Die TaqMan-Sonden technologie löst das Problem der Kombination von Fluoreszenz farbstoffen und unspezifischer Amplifi kation. Nach der Reaktion ist keine Schmelz kurven detektion erforderlich, was die Testzeit verkürzt.

Die Vorteile der TaqMan-Sonden technologie sind niedriger Fluoreszenz hintergrund, hohe Empfindlichkeit, hohe Hybrid isierungs stabilität, gute Fluoreszenz spektral auflösung und hohe Spezifität.

Aufgrund der hohen Spezifität von TaqMan-Sonden kann es zur allelischen Diskriminierung, insbesondere für menschliche Genpoly morph ismen, und zur Unterscheidung und Quant ifizierung von Stämmen basierend auf SNP verwendet werden.